細(xì)胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學(xué)污染和生物污染。

　　化學(xué)污染

　　化學(xué)污染是一些對(duì)細(xì)胞有毒性的或?qū)��?xì)胞產(chǎn)生刺激的化學(xué)物質(zhì)。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學(xué)試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等。

　　化學(xué)污染中比較引人注意的是細(xì)菌內(nèi)毒素。它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞死亡后解體釋放出的疏水性的細(xì)胞壁組成物質(zhì)，對(duì)塑料等疏水性強(qiáng)的物質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力。細(xì)菌內(nèi)毒素可刺激部分細(xì)胞產(chǎn)生一些激素或細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。細(xì)菌內(nèi)毒素是臨床上的最主要的熱原(即注射到動(dòng)物體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)熱)，所以通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗、細(xì)胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過程中更是要避免細(xì)菌內(nèi)毒素的污染。

　　生物污染

　　生物污染包括比較容易發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現(xiàn)的病毒、支原體和其他細(xì)胞的污染。

　　細(xì)菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非常快速的生長(zhǎng)。這些污染比較容易觀察到，它們往往會(huì)使其污染的培養(yǎng)液產(chǎn)生可見的變化，或者通過顯微鏡觀察就可以看見。

　　· 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因?yàn)椴《绢w粒特別微小，一般的實(shí)驗(yàn)室都沒能力檢查細(xì)胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞內(nèi)，對(duì)整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會(huì)使研究人員長(zhǎng)期得到受病毒影響的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初美國(guó)的一個(gè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在該國(guó)的細(xì)胞培養(yǎng)中，至少有15%被支原體污染。由于支原體沒有細(xì)胞壁，在細(xì)胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時(shí)對(duì)常用于細(xì)胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

　　細(xì)胞的交叉污染在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生的嚴(yán)重程度大大超過人們的想象：1981 年對(duì)ATCC細(xì)胞株的調(diào)查顯示：超過 60 標(biāo)記為其他細(xì)胞株的細(xì)胞居然是 HeLa 細(xì)胞。

　　怎么樣才能減少污染的機(jī)會(huì)?

　　減少化學(xué)污染

　　對(duì)于自己用粉末配制培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)室來說，配制培養(yǎng)液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學(xué)污染的機(jī)會(huì)。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，最好是經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試的。

　　· 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因?yàn)椴《绢w粒特別微小，一般的實(shí)驗(yàn)室都沒能力檢查細(xì)胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞內(nèi)，對(duì)整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會(huì)使研究人員長(zhǎng)期得到受病毒影響的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初美國(guó)的一個(gè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在該國(guó)的細(xì)胞培養(yǎng)中，至少有15%被支原體污染。由于支原體沒有細(xì)胞壁，在細(xì)胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時(shí)對(duì)常用于細(xì)胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

　　細(xì)胞的交叉污染在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生的嚴(yán)重程度大大超過人們的想象：1981 年對(duì)ATCC細(xì)胞株的調(diào)查顯示：超過 60 標(biāo)記為其他細(xì)胞株的細(xì)胞居然是 HeLa 細(xì)胞。

　　怎么樣才能減少污染的機(jī)會(huì)?

　　減少化學(xué)污染

　　對(duì)于自己用粉末配制培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)室來說，配制培養(yǎng)液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學(xué)污染的機(jī)會(huì)。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，最好是經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試的。

　　· 另外盡量使用一次性的細(xì)胞培養(yǎng)器皿。由于標(biāo)準(zhǔn)廠家一次性細(xì)胞培養(yǎng)器皿的生產(chǎn)環(huán)境比較嚴(yán)格，得到的產(chǎn)品潔凈度很高，從而減少了由細(xì)胞培養(yǎng)器皿帶入污染的機(jī)會(huì)。

　　減少生物污染

　　由于一般的污染發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)的操作過程中，所以良好的細(xì)胞培養(yǎng)操作環(huán)境和操作習(xí)慣是減少生物污染的關(guān)鍵。

　　要用一個(gè)專門的房間用于細(xì)胞培養(yǎng)，注意保持房間的清潔。

　　要有一個(gè)定期檢驗(yàn)的合格的超凈臺(tái)(超凈臺(tái)內(nèi)的潔凈度應(yīng)該為100級(jí)，與計(jì)算機(jī)硬盤的生產(chǎn)環(huán)境相當(dāng))。在使用超凈臺(tái)前開啟通風(fēng)裝置并打開紫外燈滅菌30分鐘。操作時(shí)要戴一次性橡膠手套，并噴灑70%酒精消毒。任何帶入超凈臺(tái)的非無菌物件都要噴灑70%酒精消毒。收集廢培養(yǎng)液的瓶子要加入漂 白液，以避免微生物的生長(zhǎng)。每次實(shí)驗(yàn)完后，要向通向廢培養(yǎng)液瓶的塑料管內(nèi)噴灑70%酒精，并且用蒸餾水和70%酒精先后擦拭臺(tái)面(只用70%酒精擦拭會(huì)導(dǎo)致灑落在臺(tái)面的培養(yǎng)液在臺(tái)面上形成難以清除的污垢)。

　　不要在超凈臺(tái)里使用酒精燈等燈具，因?yàn)檫@樣會(huì)因燈的熱的火焰引起的空氣對(duì)流而破壞超凈臺(tái)里本來規(guī)則的空氣層流，使本來存在于超凈臺(tái)底層的微粒被帶到上層，帶來更多的污染機(jī)會(huì)。

　　·加熱培養(yǎng)液的37°C恒溫水浴中非常容易有微生物的生長(zhǎng)，從而成為一個(gè)重要的污染源。所以需要定期清洗恒溫水浴。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)的用于保持濕度的水盤也需要定期清洗。為了減少不同細(xì)胞株間的相互污染，不要用同一瓶培養(yǎng)液或胰酶培養(yǎng)不同的細(xì)胞;不要在一個(gè)超凈臺(tái)上同時(shí)進(jìn)行多種細(xì)胞的操作�！　》盅b每次小量使用的溶液(如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液)，以減少多次使用時(shí)污染的機(jī)會(huì)。

　　以防萬一

　　即使再小心，污染難免還是會(huì)發(fā)生。所以得到一個(gè)新的細(xì)胞株后的第一件事情，是把細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)增后凍存起來，以備不測(cè)。

　　內(nèi)毒素是什么?

　　內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組分之一。一個(gè)活的細(xì)菌很少釋放內(nèi)毒素，但死后可放出大量?jī)?nèi)毒素。

　　內(nèi)毒素在血液中存在時(shí)會(huì)引起動(dòng)物發(fā)熱，是醫(yī)療注射液中最主要的。19 世紀(jì) 40 年代開始用注射溶液引起兔的發(fā)熱反應(yīng)實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)熱原(主要是細(xì)菌內(nèi)毒素)。后來研究者發(fā)現(xiàn)鱟(一種海洋生物)血液遇到極微量的內(nèi)毒素會(huì)發(fā)生凝血反應(yīng)，從而在19 世紀(jì) 70 年代發(fā)明了鱟試劑用于快速精確檢測(cè)內(nèi)毒素。內(nèi)毒素含量一般用國(guó)際單位( EU )來衡量，一般來說 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。

　　由于內(nèi)毒素會(huì)對(duì)很多種細(xì)胞產(chǎn)生刺激，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在實(shí)驗(yàn)中要盡量減少在培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素的來源。

　　由于生產(chǎn)工藝的提高，來自標(biāo)準(zhǔn)廠家的血清和培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素含量很少。所以現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來源主要是水、添加劑、細(xì)胞培養(yǎng)器皿等。　　傳統(tǒng)的玻璃儀器制備的雙蒸水和通過離子交換柱、活性炭柱和超濾三個(gè)環(huán)節(jié)的純水制備儀制備的超純水都能滿足細(xì)胞培養(yǎng)用水的要求。盛水器具上的細(xì)菌內(nèi)毒素可能給超純水帶來污染。長(zhǎng)時(shí)間放置的超純水也可因盛水器具上細(xì)菌生長(zhǎng)而污染細(xì)菌內(nèi)毒素。

　　內(nèi)毒素能緊密的粘在玻璃器皿上，實(shí)驗(yàn)室里用普通的方法不能完全的消除除內(nèi)毒素。用 250 ℃， 30 分鐘或 180 ℃， 2 小時(shí)干熱滅菌能完全除掉玻璃器皿上的內(nèi)毒素。

　　一次性塑料器皿經(jīng)過高溫注塑成型，沒有內(nèi)毒素存在。但在處理、包裝等生產(chǎn)過程中，可能污染內(nèi)毒素。

　　應(yīng)該選用什么樣的抗生素和相應(yīng)的濃度?

　　抗生素在五十年代開始細(xì)胞培養(yǎng)中得到使用。它大大減少了細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)菌等微生物污染的機(jī)會(huì)，從而使細(xì)胞培養(yǎng)在普通實(shí)驗(yàn)室就可以輕易操作。

　　·最常用的抗生素是芐基青霉素鉀鹽 (Penicillin G potassium )和鏈霉素硫酸鹽 ( Streptomycin sulphate)的混合液，通稱PS。青霉素抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素則抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。一般青霉素的濃度為10,000U/ml, 鏈霉素的濃度為10,000ug/ml。青霉素在普通的醫(yī)院或藥店可以買到。鏈霉素由于對(duì)聽覺神經(jīng)具有損害，已經(jīng)很少用于醫(yī)療，所以需要向?qū)ｉT的化學(xué)試劑公司購(gòu)買。

　　有一些培養(yǎng)過程污染源比較多，比如組織培養(yǎng)。為了減少污染，常常需要在培養(yǎng)液中加入其他的抗生素。比如慶大霉素(Gentamycin sulfate，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成)， 兩性霉素B (amphotericin B，干擾含膽固醇的細(xì)胞膜的功能，抑制酵母和真菌的生長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞也具有一定的毒性)等。

　　可用于細(xì)胞培養(yǎng)的抗生素種類非常多，如果細(xì)胞培養(yǎng)過程比較特殊，污染源比較多，可以考慮選用其他的抗生素。

　　即使使用多種抗生素的組合，污染還是有可能發(fā)生。所以減少污染的關(guān)鍵，是規(guī)范的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作�？股�素的使用，也會(huì)使一些污染長(zhǎng)期潛伏，同時(shí)與五十年代抗生素開始引入細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)相比，現(xiàn)在的過濾技術(shù)，超凈臺(tái)的質(zhì)量等都已經(jīng)有了很大的提高，在培養(yǎng)過程中帶入污染的機(jī)會(huì)大大減小了，所以有不少人建議在普通的細(xì)胞培養(yǎng)過程中不要使用抗生素。

　　為什么有人提倡細(xì)胞培養(yǎng)液中不要加抗生素?

　　抗生素雖然減少了可以觀察到的細(xì)菌、酵母等微生物的污染機(jī)會(huì)，卻會(huì)增加支原體、病毒等隱性污染的機(jī)會(huì)。

　　因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)中污染主要來源于空氣中的微粒和汽霧，而這些微粒和汽霧可以同時(shí)攜帶支原體、病毒和其他微生物。當(dāng)抗生素使用時(shí)，可見污染被抑制而隱性污染又沒被注意到，這樣支原體、病毒等隱性污染的機(jī)會(huì)反而增加了。Barile的一項(xiàng)研究顯示(1)，72%持續(xù)使用抗生素培養(yǎng)的細(xì)胞有支原體污染，而不使用抗生素培養(yǎng)的細(xì)胞支原體污染的比例只有7%。

　　反過來如果不使用抗生素，支原體、病毒的污染往往會(huì)伴隨細(xì)菌和酵母等的污染。由于細(xì)菌和酵母等的污染很容易觀察到，污染細(xì)胞的及時(shí)清理就大大減少了支原體、病毒的污染機(jī)會(huì)。

　　潛在的支原體、病毒的污染會(huì)帶來很大的危害。這些微生物的存在會(huì)影響細(xì)胞的理化性質(zhì)，從而使研究者得到錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在嚴(yán)重的情況下，甚至使一個(gè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)年的研究白白浪費(fèi)。

　　由于過濾技術(shù)的提高和超凈臺(tái)質(zhì)量的改進(jìn)，在規(guī)范的細(xì)胞培養(yǎng)操作過程中引進(jìn)污染的機(jī)會(huì)已經(jīng)被大大降低了。所以比較合理的建議是，在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)中不要使用抗生素。只有在培養(yǎng)污染源很多(比如組織培養(yǎng))，或者培養(yǎng)非常珍貴的細(xì)胞株時(shí)才使用抗生素。

　　1. Barile, M. F. Mycoplasmal Contamination of Cell Cultures: mycoplasma-Virus-Cell Culture Interactions. in Contamination in Tissue Culture, J. Fogh, ed. (Academic Press, Inc., New York, 1973) 131-171. 38. Perlman, D. Use of Antibiotics in Cell

　　直接培養(yǎng)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染

　　特點(diǎn): 最直接最靈敏的檢測(cè)手段。

　　缺點(diǎn)： 培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，需3-5周才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基上培養(yǎng)出來(例如M. hyorhinis)。需要同時(shí)培養(yǎng)支原體菌株作陽(yáng)性對(duì)照，可能會(huì)造成污染。

　　材料： 葡萄糖、L-鹽酸精氨酸、Difco PPLO broth(Difco 0554-17-1)、馬血清、15%酵母膏溶液(高壓滅菌)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(高壓滅菌)、無菌培養(yǎng)皿(60x15mm)、玻璃棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸(厭氧缸長(zhǎng)期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應(yīng)該用無菌水，每次打開厭氧缸后用70%酒精擦拭內(nèi)壁。)

　　培養(yǎng)基準(zhǔn)備： 基本配方為Difco PPLO broth(60%)，馬血清(20%)，15%酵母膏溶液(10%)，10x儲(chǔ)存液(10%)。由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，可加50u/ml青霉素至10x儲(chǔ)存液或加入乙酸鉈(1：2000)至培養(yǎng)基中以防止其他細(xì)菌的污染。

　　10x儲(chǔ)存液(1升)： 稱取50克葡萄糖，10克L-鹽酸精氨酸溶于1升蒸餾水中。用0.22μm無菌過濾膜過濾除菌，分裝100ml至瓶中，-70℃保存。

　　液體培養(yǎng)基(1升)： 稱取21克Difco PPLO broth，0.02克酚紅于600ml蒸餾水中加熱攪拌溶解。滅菌121℃15分鐘滅菌。待溫度降低至室溫后于無菌操作臺(tái)內(nèi)加入200ml馬血清，100ml 15%酵母膏溶液及100ml解凍的10x儲(chǔ)存液，混合均勻后分裝至已滅菌的有蓋螺旋試管中，10ml/管。4℃保存，保存期限為1個(gè)月。