現(xiàn)實(shí)需求：手性藥物的不同對(duì)映體往往顯示出不同的藥理學(xué)、毒理學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，出于用藥安全性考慮，藥品監(jiān)管部門(mén)要求對(duì)潛在手性藥物的各自對(duì)映體必需進(jìn)行分離和活性(毒性)測(cè)試。因此，單一構(gòu)型手性化合物的獲得對(duì)于藥理和毒理實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展是極其重要的。一般可以通過(guò)手性合成和手性拆分兩種途徑來(lái)獲取單一異構(gòu)體。

　　案例分析：mg-50g級(jí)的單一構(gòu)型手性化合物各自純品(即兩種構(gòu)型都需要)。其中之一很可能就是安全有效的候選藥物。為了盡快獲得各異構(gòu)體以盡早開(kāi)展藥理、毒理試驗(yàn)，藥物發(fā)現(xiàn)階段，許多制藥公司都暫緩在不對(duì)稱(chēng)合成上的投入，而是敏銳快捷地轉(zhuǎn)向手性色譜分離，迅速地從不太貴的消旋體混合物中分離出高純度的對(duì)映體。手性藥物早期開(kāi)發(fā)階段，不差錢(qián)!這時(shí)候最要緊的是時(shí)間和對(duì)映體純度。時(shí)間就是金錢(qián)，早期占得先機(jī)，后來(lái)財(cái)源滾滾!

　　解決方案：藥物發(fā)現(xiàn)階段，由于手性化合物需求量少(mg-50g級(jí)，相對(duì)于后期公斤級(jí)全面開(kāi)發(fā)及噸位級(jí)生產(chǎn)來(lái)講，小巫見(jiàn)大巫。。。)，為盡快盡早獲得單一光學(xué)純物質(zhì)，采用手性色譜制備分離策略。

　　具體方法：擬采用多糖類(lèi)手性固定相高效液相色譜法(PreparativeChiralHPLC)

　　方法步驟：手性HPLC制備分離對(duì)映體，對(duì)于某一個(gè)具體樣品，如何開(kāi)始chiralHPLC方法建立?對(duì)映體在手頭上已有商品柱上能否直接分離，是否可以放大等?

　　對(duì)于液相色譜法手性制備拆分對(duì)映體，其步驟大致如下：1)、了解待分離化合物樣品結(jié)構(gòu)信息;2)、選擇合適的手性固定相(手性分析柱);3)、對(duì)所選的分析柱進(jìn)行篩選，優(yōu)化色譜條件;4)將分析條件轉(zhuǎn)移到制備柱上，并對(duì)放大分離條件做最后的調(diào)整(analyticalchiralHPLC→preparativechiralHPLC);5)、開(kāi)始制備拆分，若條件允許的話(huà)，可以自動(dòng)進(jìn)樣;6)去除溶劑，回收產(chǎn)品。具體操作起來(lái)，可以這么考慮：

　　1)、了解待分離化合物樣品結(jié)構(gòu)信息：手性方法建立的第一步為檢查待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，盡可能地獲取樣品的如下信息——在不同溶劑中的溶解度(由于是制備分離，我們期望盡量多的樣品溶于相對(duì)小的溶劑中。除了分離選擇性，樣品溶解度通常是建立PreparativeChiralHPLC方法的主要障礙。許多情況下，樣品因在流動(dòng)相中沒(méi)有足夠大的溶解度，因而影響單針上樣量，更甚至于沉積于制備柱上而無(wú)法洗脫。);形成氫鍵H-、π鍵或者偶極相互作用的能力;是否有極性官能團(tuán)(是否含氨基NH2-、羧基-COOH或者既含酸性基團(tuán)又有堿性基團(tuán));手性中心附近有無(wú)大取代基;紫外光譜可否檢測(cè)等。諸如此類(lèi)的樣品結(jié)構(gòu)信息對(duì)預(yù)判手性分離能力及手性固定相的選擇有較大的幫助作用。

　　2)、怎樣選擇合適的手性柱：由于手性方法是用于制備分離，在選擇手性柱時(shí)就應(yīng)考慮柱容量(柱樣品荷載量)。從手性固定相通用性考慮，各商品化的手性柱通用性大致順序?yàn)椋憾嗵侵�﹥蛋白柱﹥糖肽柱﹥配體交換柱。

　　多糖類(lèi)手性固定相基于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)特征在手性分離方面顯示出卓越的性能，已經(jīng)廣泛用于各種各樣手性分子對(duì)映體的分析和制備分離。所以，選定多糖柱作為制備分離用手性柱。

　　3)、手性色譜條件優(yōu)化：手性液相色譜法，與普通液相色譜類(lèi)似，方法建立時(shí)主要包括手性柱的篩選和流動(dòng)相條件的優(yōu)化兩個(gè)方面。

　　手性柱篩選方面，即便是在選定多糖類(lèi)手性柱的情況下，由于有多種柱型可供選擇，以致于難于確定最好以哪一種柱子開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。據(jù)已報(bào)導(dǎo)的大部分應(yīng)用研究，Daicel公司“四大金剛”淀粉類(lèi)ChiralpakAD-H、ChiralpakAS-H和纖維素類(lèi)Chiralcel-OD-H、ChiralpakOJ-H聯(lián)合使用可成功分離80%未知樣品。但依據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，最英明神武的決策是重用“兩大護(hù)法”-ChiralpakAD-H和Chiralcel-OD-H(或者新型共價(jià)鍵合手性柱ChiralpakIA和ChiralpakIC)，這兩者在多糖類(lèi)手性柱中應(yīng)用最為廣泛，可用于多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型樣品的分離。直鏈淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)和纖維素的線(xiàn)性結(jié)構(gòu)，在對(duì)映體拆分方面具有手性分離互補(bǔ)特征，ChiralpakAD-H和Chiralcel-OD-H(或者ChiralpakIA和ChiralpakIC)配合使用，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，珠聯(lián)璧合，大大的好。。。

　　流動(dòng)相條件的優(yōu)化方面，多糖類(lèi)手性柱大多在正相模式下分離。方法建立初始階段，首先嘗試在ChiralpakAD-H柱(或ChiralpakIA柱)上，以無(wú)水乙醇/正己烷為流動(dòng)相，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相中醇的含量或者改變醇的種類(lèi)來(lái)增強(qiáng)對(duì)映體分離選擇性。如果只有部分分離或者仍沒(méi)有分離，可在流動(dòng)相中添加有機(jī)酸、堿等改性劑來(lái)優(yōu)化分離。同時(shí)，可以考察柱溫對(duì)分離的影響。如果發(fā)現(xiàn)分離還不理想，再使用另一殺手锏，換用Chiralcel-OD-H(或ChiralpakIC)柱，重復(fù)考察前面的各影響因素。若背，喝涼水都塞牙——使用多糖類(lèi)手性柱未能獲得滿(mǎn)意的分離度，則另做打算嘗試其他類(lèi)型的手性柱。

　　手性色譜條件優(yōu)化流程總結(jié)如下：

　　4)、分析方法轉(zhuǎn)移：一旦合適的分析條件被確定下來(lái)，手性制備分離的第一步旗開(kāi)得勝，接下來(lái)的工作進(jìn)展就相當(dāng)?shù)仨樌�了。一般�?lái)說(shuō)，用于制備分離的填料粒徑(20um)要大于以分析為目的的手性固定相粒徑(5um)，同時(shí)色譜柱的尺寸也有所不同。分析條件轉(zhuǎn)換到半制備、制備規(guī)模上來(lái)，主要是流速和進(jìn)樣量的調(diào)整。制備之前，最好先作“理論分析”(或者憑以往實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)預(yù)判)，接著做小批量的實(shí)驗(yàn)逐步證實(shí)，放大分離。

　　5)、制備分離：制備手性液相色譜(PreparativeChiralHPLC)，除了在分析型AnalyticalHPLC上摸索分離條件之外，一般來(lái)講，樣品的溶解度非常重要。若樣品在流動(dòng)相中沒(méi)有足夠大的溶解度，這使得樣品濃度不高因而嚴(yán)重制約單針上樣量。多糖類(lèi)手性柱大多在正相模式下分離，使用醇/正己烷作為流動(dòng)相體系，等度洗脫。實(shí)際應(yīng)用中，越擔(dān)心什么偏偏就發(fā)生什么，經(jīng)常會(huì)糾結(jié)于正相分離模式下樣品溶解度不夠大的問(wèn)題。針對(duì)樣品溶解度問(wèn)題，具體問(wèn)題具體分析，特殊情況特殊關(guān)照，想方設(shè)法提高樣品的溶解度。

　　提高樣品溶解度的策略：總體原則是——千方百計(jì)，想方設(shè)法增大樣品溶解度，但不改變?nèi)軇┫疵搹?qiáng)度或者影響分離選擇性。

　　策略一：從樣品化合物結(jié)構(gòu)自身入手，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾，引入保護(hù)基做成衍生物來(lái)增強(qiáng)其在有機(jī)溶劑中的溶解度。原則是通過(guò)衍生物使溶解性變好，且不影響對(duì)映體分離選擇性或者提高其選擇性，同時(shí)保護(hù)基容易引入和脫除。比如某些類(lèi)型的手性胺(伯胺和仲胺)，加上一個(gè)Boc或者Cbz保護(hù)基，溶解性會(huì)戲劇性地變好，方便很好地進(jìn)行分離。

　　策略二：若流動(dòng)相不能溶解足夠量樣品，則可以探索不同于流動(dòng)相的樣品溶劑。比如，先用能溶解更多樣品的單一溶劑(諸如異丙醇或者無(wú)水乙醇)溶解待分離物，然后用流動(dòng)相稀釋?zhuān)�以不析出為�?或者根據(jù)樣品化合物結(jié)構(gòu)，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值或者樣品溶劑離子強(qiáng)度的變化來(lái)增加樣品溶解度，比如溶解樣品時(shí)，往溶劑中添加一定體積的有機(jī)酸(冰乙酸、三氟乙酸)、有機(jī)堿(二乙胺、三乙胺)、離子對(duì)試劑(甲基磺酸、乙基磺酸)等來(lái)助溶，但前提是以不影響化合物的穩(wěn)定性和對(duì)映體色譜分離選擇性為準(zhǔn)。樣品溶劑對(duì)色譜分離的影響，可在分析型chiralHPLC上考察，然后轉(zhuǎn)移到制備上。

　　策略三：巧用重迭進(jìn)樣(stackinjection)。我們知道，在RP-HPLC梯度洗脫條件下，進(jìn)樣后，待測(cè)物必須完全流出色譜柱后才能進(jìn)下一針，即進(jìn)樣是間歇式的。但正相模式下的手性分離，等度洗脫，根據(jù)樣品化合物出峰時(shí)間，可以有針對(duì)性地選擇間歇式的單針進(jìn)樣還是重迭進(jìn)樣(即上一針還未洗脫下來(lái)，掐算好出峰時(shí)間，把握時(shí)機(jī)進(jìn)下一針)。重迭進(jìn)樣(stackinjection)省時(shí)增效、節(jié)能減排，綠色環(huán)保，符合建設(shè)資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會(huì)的時(shí)代要求。比如某手性制備拆分，若單針進(jìn)樣的話(huà)，需要運(yùn)行32min，兩異構(gòu)體在16.5-30min時(shí)間段出峰，前16min時(shí)間柱上分離近似于在走基線(xiàn)，同時(shí)留意到兩個(gè)色譜峰16min內(nèi)能完全流出色譜柱。類(lèi)似這種情況下，我們就可以考慮使用重迭進(jìn)樣的策略來(lái)縮短分離時(shí)間，節(jié)省溶劑消耗，降低廢液排放。

　　6)、回收產(chǎn)品：去除溶劑，這一點(diǎn)與反相制備色譜類(lèi)同，但手性制備分離是在正相模式等度洗脫條件下進(jìn)行的，溶劑回收后可以循環(huán)再利用，繼續(xù)用于該分離項(xiàng)目。在實(shí)際工作中踐行循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展理念，建設(shè)生態(tài)文明社會(huì)。如何確定所得兩個(gè)異構(gòu)體的立體構(gòu)型，R-、S-型洗脫順序怎樣呢?這點(diǎn)可在除去溶劑后，旋光儀測(cè)定偏振光方向，正( )還是負(fù)(-)，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)值比對(duì)，即可確定R-、S-構(gòu)型。條件優(yōu)越的話(huà)，可使用在線(xiàn)旋光檢測(cè)器或者圓二色檢測(cè)器跟蹤對(duì)映體的洗脫順序。

　　歸納總結(jié)：手性色譜法是最重要的手性分離技術(shù)之一，不僅可以快速地測(cè)定對(duì)映體純度(對(duì)映體過(guò)量值)，而且也可以用于制備拆分光學(xué)異構(gòu)體。在眾多已商品化的手性固定相中，多糖類(lèi)手性固定相因分離選擇性好、柱容量大而被廣泛使用。本文探討了多糖類(lèi)手性固定相在制備分離中的應(yīng)用，快速篩選手性固定相(手性柱)和優(yōu)化流動(dòng)相條件(醇等調(diào)節(jié)劑和改性劑)是成功的關(guān)鍵。同時(shí)，樣品溶解度是影響拆分速度的一個(gè)重要因素。可以與其它較便宜的純化方法(重結(jié)晶、化學(xué)拆分法)相結(jié)合以降低操作的總體成本。