沉降系數(shù)測(cè)定是分析離心機(jī)最主要的用途。通常只需要幾十毫克甚至幾十微克樣品，配制成1~2毫升溶液，裝入分析池，以幾小時(shí)的分析離心，就可以獲得一系列的樣品離心沉降圖。根據(jù)沉降圖可以作樣品所含組分的定性分析，亦可以測(cè)定各組分的沉降系數(shù)和估計(jì)分子大小，作樣品純度檢定和不均一性測(cè)定，以組分的相對(duì)含量測(cè)定。

　　1.原理

　　沉降系數(shù)的測(cè)定原理就是在恒定的離心力場(chǎng)下測(cè)定樣品顆粒的沉降速度。因?yàn)闃悠奉w粒很小，不能直接看到它們的沉降運(yùn)動(dòng)，所以把離心時(shí)樣品顆粒的界面移動(dòng)速度看作是樣品顆粒的平均沉降速度。通常使用Schlieren和吸收光學(xué)系統(tǒng)來(lái)記錄界面沉降圖。在沉降圖中樣品界面一般表現(xiàn)為一個(gè)對(duì)稱的峰，峰的最高點(diǎn)代表界面位置。通常沉降系數(shù)測(cè)量精度為±2%,但是如果面界圖型表現(xiàn)為不對(duì)稱峰型，或希 望沉降系數(shù)測(cè)量精度達(dá)到±1%或更小的情況時(shí)，按峰的最高點(diǎn)作為界面位置就不夠了這時(shí)應(yīng)該使用二階距法計(jì)算界面位置。

　　2.沉降系數(shù)測(cè)定實(shí)例

　�、艠悠罚号Ｑ�清白蛋白

　　⑵樣品溶液與離心：按0.6%濃度將牛血清白蛋白溶于0.14M NaCl、0.01M磷酸緩沖液中，pH7.0。用12mm厚雙槽分析池，一邊加入溶液一邊加入溶劑，約各0.3ml。分析池與平衡池平衡重量，使平衡池比分析池輕0.5g以內(nèi)，然后分別裝入分析轉(zhuǎn)頭。分析轉(zhuǎn)頭裝于分析離心為什么，關(guān)轉(zhuǎn)動(dòng)腔，抽真空。開 Schlieren光光源，選擇工作速度一60000轉(zhuǎn)/分，離心室溫。轉(zhuǎn)動(dòng)腔達(dá)到真空后離以機(jī)開始運(yùn)轉(zhuǎn)加速，此時(shí)在觀察窗口可以看到離心圖型。達(dá)到工作速度后即為恒速離心。待看到樣品峰的尖端后即可以6分 鐘間隔照相，共照6張。照完相即可關(guān)機(jī)，取出樣品液，清理轉(zhuǎn)頭和分析池。照相用強(qiáng)反差顯影沖洗后即得Schlieren光路沉降圖形照片。

　�、浅两祱D象測(cè)量：Schlieren沉降圖可以用比長(zhǎng)儀，讀數(shù)顯微鏡，或投影儀測(cè)量。要求測(cè)量的橫向量程為6cm，測(cè)量精度應(yīng)優(yōu)于10μm。通常讀數(shù)顯微鏡已能滿足要求。投影儀可以使圖象放大于屏幕上，讀測(cè)比較容易，眼睛不易疲勞。測(cè)量時(shí)把沉降圖象的底片放于測(cè)量?jī)x器上，使液面的垂直線與測(cè)量?jī)x中的垂直線重合，然后用十字標(biāo)線依次測(cè)量?jī)?nèi)參孔，液面，界面峰尖，和外參考孔的位置，每個(gè)圖象至少讀測(cè)三次，取平均值。依次把每個(gè)圖象依同樣方法測(cè)量，把數(shù)據(jù)列成表。

　　照相號(hào) x1(mm) x2(mm) x3(mm) x4(mm) (x3-x1)/a log[5.65+(x3-x1)/a]

　　1 45.426 37.626 33.807 13.810 0.6125 0.7967

　　2 45.640 37.830 33.351 13.420 0.6485 0.7992

　　3 45.890 38.070 32.895 13.663 0.6854 0.8017

　　4 45.733 37.921 32.163 13.523 0.7161 0.8039

　　5 45.802 38.000 31.580 13.593 0.7507 0.8062

　　6 46.009 38.211 31.172 13.800 0.7830 0.8084

　　(4)沉降系數(shù)S的計(jì)算：沉降圖測(cè)量完，先檢查每一張圖和第六張圖的x2-x1值，二張圖的x2-x1值的差應(yīng)該小于界面峰位置的測(cè)量誤差。實(shí)測(cè)x2-x1的差值為0.002，說(shuō)明液面在離心30分鐘內(nèi)變動(dòng)為 0.002mm。界面峰在30分鐘內(nèi)移動(dòng)距離是第六號(hào)圖的x1-x3減第一號(hào)圖的x1-x3，是3.208mm,其峰位測(cè)量意味著允許為0.03。可內(nèi)陸液面變動(dòng)0.002mm遠(yuǎn)小于峰位測(cè)量誤差0.03mm，說(shuō)明離心時(shí)沒(méi)有發(fā)生漏液。

　　按a=(x4-x1)/1.7求算光路對(duì)分析池的放大倍數(shù)，然后按(x3-x1)/a求算界面峰離開內(nèi)參考孔的實(shí)際距離，再按x=5.65+(x3-x1)/a求算界面峰離開旋轉(zhuǎn)中心的實(shí)際距離，再由對(duì)數(shù)表求算logx植，計(jì)算數(shù)據(jù)亦列于表5中。

　　3.離心圖象的分析

　　當(dāng)離心剛開始時(shí)如果見到有快速沉降的峰，幾分鐘內(nèi)就到達(dá)分析池底部，一般多是由于樣品發(fā)生部分聚合形成快速沉降的高聚物，如蛋白質(zhì)樣品液遇到某些變性因素時(shí)會(huì)部分變性而沉淀。離心達(dá)速后樣品的的記心圖象顯示一個(gè)對(duì)稱的峰形，一般可以認(rèn)為樣品是離心均一的。但是對(duì)樣品的真正均一性還應(yīng)用其他方法進(jìn)一步檢測(cè)，如電泳，層析等。某些混合樣品偶然亦會(huì)給出一個(gè)對(duì)稱峰的。峰形通常會(huì)隨時(shí)間而擴(kuò)展，這是由于樣品擴(kuò)散的結(jié)果。但如果峰形擴(kuò)展很快，則該樣品可能是多分散性的。如果離心圖象中表現(xiàn)幾個(gè)峰，說(shuō)明樣品中有幾個(gè)組分，每一個(gè)峰代表相應(yīng)組分的沉降界面，因此可以測(cè)定每一個(gè)組分的沉降系數(shù)值。根據(jù)峰的面積可以測(cè)量組分的濃度值。

　　有時(shí)離心的圖象表現(xiàn)出一個(gè)不對(duì)稱的峰，這可能是由于下列幾種情況所致。

　　①幾個(gè)沉降系數(shù)接近的組分峰形重疊，

　�、跇悠肥嵌喾稚⑿缘�，其分子量分布不均勻

　�、勰承┫嗷プ饔脧�(qiáng)的高分子，其沉降速度對(duì)濃度依賴很大，如DNA，多糖分子，若測(cè)定于高濃度，在界面區(qū)由于濃度變化造成沉降速度不一致而致峰形呈不對(duì)稱分布。這類樣品在更大濃度時(shí)甚至?xí)�形成一非常尖銳的界面，在離心沉降圖中表現(xiàn)成一根垂直線，看不到任何峰形。根據(jù)這種圖形測(cè)定沉降系數(shù)誤差將很大。通常這類樣品應(yīng)該測(cè)定于很稀的濃度，此條件下分子相互作用變小，界面擴(kuò)展的峰形，才可以測(cè)到正確的沉降系數(shù)。

　　4.樣品的純度和濃度測(cè)定

　　分析離心機(jī)可以測(cè)定樣品的純度和濃度，這亦是分析離心用途。通常樣品的離心圖形表現(xiàn)一個(gè)對(duì)稱峰形時(shí)，可認(rèn)為該樣品是離心均一的。但是在作純度測(cè)定時(shí)還要注意樣品的測(cè)定濃度，應(yīng)該使樣品測(cè)定濃度大于測(cè)定方法的靈敏度一百倍以上，測(cè)定才有意義。譬如Schlieren光路對(duì)該樣品測(cè)定靈敏度為 0.1mg/ml，那么該樣品測(cè)純度時(shí)的濃度應(yīng)該是90mg/ml。假如選用樣1mg/ml濃度測(cè)定，沉降圖形即使表現(xiàn)單一峰，仍不能確定其純度是0%還是99%。如果樣品是多組分的，離心圖中表現(xiàn)幾個(gè)峰，根據(jù)每個(gè)峰的面積與所有峰的總面積的比值可以得到每個(gè)組分的相對(duì)濃度值。在計(jì)算時(shí)應(yīng)該考慮輻射稀釋效應(yīng)，即把各個(gè)組分的面積值根據(jù)其所在位置用輻射稀釋公式校正到液面處的值，然后計(jì)算相對(duì)。還要注意這樣的濃度估測(cè)是建立在各個(gè)組分具有相同的折射率比值的假設(shè)基礎(chǔ)上的。根據(jù)峰形面積結(jié)合該組分的濃度與折射率比值和儀器常數(shù)還可以計(jì)算該組掃的絕對(duì)濃度值。

　　5.帶狀沉降法

　　帶狀沉降法類似于速率區(qū)帶離心法。方法使用合成界面池，在池中預(yù)先加入0.55ml的1M NaCl溶液，然后地2000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下鋪上0.01ml樣品液，然后加速到30000轉(zhuǎn)/分，用吸收光路記錄樣品沉降圖形。由于NaNl向樣，品帶擴(kuò)散形成一密度梯度區(qū)，可以穩(wěn)定沉降的樣品區(qū)帶。樣品中如果有多個(gè)沉降系數(shù)不同的組分，它們將依各自的沉降速度呈區(qū)帶沉降。利用這個(gè)方法可以檢定樣品純度，估測(cè)組成的相對(duì)含量和沉降系數(shù)。適用于微量的核酸和病毒樣品的分析測(cè)定。

　　離心機(jī)是利用離心力對(duì)混合液(含有固形物)進(jìn)行分離和沉淀的一種專用儀器。實(shí)驗(yàn)室常用電動(dòng)離心機(jī)有低速、高速離心機(jī)和低速、高速冷凍離心機(jī)，以及超速分析、制備兩用冷凍離心機(jī)等多種型號(hào)。其中以低速(包括大容量)離心機(jī)和高速冷凍離心機(jī)應(yīng)用最為廣泛，是生化實(shí)驗(yàn)室用來(lái)分離制備生物大分子必不可少的重要工具。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，欲使沉淀與母液分開，常使用過(guò)濾和離心兩種方法。但在下述情況下，使用離心方法效果較好。

　�、佟〕恋碛姓承曰蚰敢赫吵�。

　�、凇〕恋眍w粒小，容易透過(guò)濾紙。

　�、邸〕恋砹窟^(guò)多而疏松。

　�、堋〕恋砹亢苌伲�需要定量測(cè)定�；蚰敢毫亢苌�，分離時(shí)應(yīng)減少損失。

　�、荨〕恋砗湍敢罕仨氀杆俜珠_。

　�、蕖∫话隳z體溶液。