1、 電泳法(三個主要的方法，步驟)

　　電泳法

　　電泳法是指帶電荷的供試品(蛋白質、核苷酸等)在惰性支持介質(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其含量(%)的方法。

　　各電泳法，除另有規(guī)定外，照下述方法操作.

　　第一法 紙電泳法

　　1.儀器裝置 包括電泳室及直流電源兩部分。

　　常用的水平式電泳室裝置如圖，包括兩個電泳槽A和一個可以密封的玻璃(或相應材料)蓋B;兩側的電泳槽均用有機玻璃(或相應材料)板C分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5～0.8cm)D;里格為可放濾紙E的有機玻璃電泳槽架F，此架可從槽中取出;兩側電泳槽A內的鉑電極D經(jīng)隔離導線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源，常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般在500～10 000V。

　　2. 操作法

　　(1) 電泳緩沖液 枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)。取枸櫞酸 (C6H8O7•H2O)

　　39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7•2H2O)4.12g，加水4000ml，使溶解。

　　(2) 濾紙 取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干，備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm的濾紙，或根據(jù)電泳室的大小裁剪，并在距長度方向一端5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm處做一記號備點樣用。

　　(3) 點樣 有濕點法和干點法。濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中，濕潤后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點加供試品溶液，每點10μl,共3點，并留2個空白位置。干點法是將供試品溶液點于濾紙上，吹干、再點，反復數(shù)次，直至點完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕，點樣處最后噴濕，本法適用于稀的供試品溶液。

　　(4) 電泳 于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒鉑電極，接通電泳儀穩(wěn)壓電源檔,

　　調整電壓梯度為18～20V/cm，電泳約1小時45分鐘，取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點的位置。

　　(5) 含量測定 剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙，剪成細條,分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時，用3號垂熔玻璃漏斗濾過，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥品項下的規(guī)定測定吸收度，并按吸收系數(shù)計算含量.

　　第二法 醋酸纖維素薄膜電泳法

　　1.儀器裝置 電泳室及直流電源同紙電泳。

　　2.試劑 (1) 巴比妥緩沖液(pH8.6) 取巴比妥2.76g、巴比妥鈉15.45g，加水溶解

　　使成1000ml。

　　(2) 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

　　(3) 漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。

　　(4) 透明液 取冰醋酸25ml，加無水乙醇75ml，混勻。

　　3.操作法 (1) 醋酸纖維素薄膜 取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm的膜條，將無光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夾于濾紙中，輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經(jīng)濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。

　　(2) 點樣與電泳 于膜條上距負極端2cm處，條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2～3μl,在10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區(qū)帶距離以4～5cm為宜。

　　(3) 染色 電泳完畢，將膜條取下浸于氨基黑染色液中，2～3分鐘后，用漂洗液浸洗數(shù)次，直至脫去底色為止。

　　(4) 透明 將洗凈并完全干后的膜條浸于透明液中10～15分鐘，取出平鋪于潔凈的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度計上測定和作標本長期保存。

　　(5) 含量測定 未經(jīng)透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規(guī)定的方法測定，一般采用洗脫法或掃描法，測定各蛋白質組分的相對含量(1%)。

　　洗脫法 將洗凈的膜條用濾紙吸干，剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區(qū)帶，分別浸于1.6%的氫氧化鈉溶液中，振搖數(shù)次，至洗脫完全， 于一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位，同法操作作對照。先計算吸收值總和，再計算各蛋白組分所占比率(1%).

　　第三法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法

　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白的原理是根據(jù)大多數(shù)蛋白都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結合成復合物,使蛋白分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白分子的凈電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應,使蛋白按分子大小分離。

　　1.儀器裝置 恒壓或恒流電源、垂直板或圓盤電泳槽和制膠模具。

　　2.試劑

　　(1)30%丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺60g與亞甲基雙丙烯酰胺1.6g，加水至

　　200ml，濾紙濾過，避光保存。

　　(2)分離膠緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷36.3g、加水70ml，用鹽酸調節(jié)pH值至8.8，加水至100ml。

　　(3)濃縮膠緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷6.0g、加水70ml，用鹽酸調節(jié)pH值至6.8，加水至100ml。

　　(4)電泳緩沖液 取三羥甲基氨基甲烷6.0g、甘氨酸28.8g、十二烷基硫酸鈉1.0g，加水至1000ml。

　　3.操作法

　　(1)制膠 用30%丙烯酰胺溶液-分離膠緩沖液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過硫酸銨溶液(新鮮配制)-四甲基乙二胺-水(5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)制成分離膠液，灌入模具內至一定高度(剩余體積留作制備濃縮膠用)，用水封頂，聚合完畢，傾去水層。再用30%丙烯酰胺溶液-濃縮膠緩沖液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過硫酸銨溶液-四甲基乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)制成濃縮膠液，灌在分離膠上，插入樣品梳(如為圓盤電泳，用水封頂)，待濃縮膠液聚合后，小心除去樣品梳或水。

　　(2)對照品和供試品溶液的制備 照各藥品項下的規(guī)定。

　　(3)電泳 垂直板電泳：恒壓電泳，初始電壓為80V，進入分離膠時調至150～200V，當溴酚藍遷移膠底處，停止電泳。圓盤電泳：調節(jié)電流使每管8mA。

　　4.固定與染色

　　(1)考馬斯亮藍染色

　�、僭噭� a.固定液 稱取三氯醋酸5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加水

　　至500ml。b.染色液 稱取考馬斯亮藍R<[250]>0.5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml與冰醋酸50ml，再加水至500ml。c.脫色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000ml，充分混合。d.保存液 取冰醋酸75ml，加水至1000ml，搖勻。

　　②固定與染色 電泳完畢，取出膠片(條)，置固定液中30分鐘，取出膠片(條)，置染色液中1～2小時，用脫色液脫色至凝膠背景透明后保存在保存液中。

　　(2)銀染色

　�、僭噭� a.硝酸銀溶液 取硝酸銀0.8g，加水至4.0ml，將此溶液滴加到0.1mol/

　　L氫氧化鈉溶液20ml與25%氨溶液1.5ml的混合液中，搖勻，用水稀釋至100ml。

　　b.固定液 取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl，加水至100ml。

　　c.顯色液 取1%枸櫞酸溶液2.5ml、37%甲醛溶液270μl，加水至500ml。

　　d.終止液 取冰醋酸100ml，加水至1000ml。

　�、诠潭ㄅc染色 膠片浸在固定液中至少2小時后棄去固定液，用水浸洗至少1小時;膠片置1%戊二醛溶液中15分鐘后，用水洗2次，每次15分鐘;膠片置硝酸銀溶液中15分鐘后，用水洗3次，每次15分鐘;膠片置顯色液中，待各帶顯出后置終止液中。

　　5.計算

　　用卡尺或用掃描定位法測量溴酚藍指示劑和蛋白遷移距離(如為圓盤電泳還應測量染色前后膠條長度，垂直板電泳膠片厚度低于1mm，染色前后膠片長度基本不變)。按下式計算相對遷移率：

　　蛋白遷移距離 脫色前膠條長度

　　相對遷移率(R’<[m]>)=

　　脫色后膠條長度 溴酚藍指示劑遷移距離

　　(1)分子量 以R’<[m]>為橫坐標，標準蛋白的分子量對數(shù)為縱坐標，進行線性回

　　歸，由標準曲線求得供試品的分子量。

　　(2)純度 取膠片(條)，置薄層掃描儀，以峰面積按歸一化法計算。

　　(3)結果判斷 供試品主成分遷移率應與對照品遷移率一致.

　　2、 制備凝膠板的方法

　　等電聚焦電泳與瓊脂糖電泳過程中凝膠板的制備方法和簡單操作

　　等電聚焦電泳

　　1.制備凝膠板

　　1)30%凝膠母液的制備

　　丙烯酰胺30克，N、N雙甲叉丙烯酰胺0.8克，加蒸餾水至100毫升，溶解后過濾,貯存于有色瓶內.

　　2)準備制膠模具

　　準備玻璃板涼快，相應壓條三根.同樣大小的玻璃紙及聚碳酸脂薄膜各一張(也可不用).文具夾若干.上述用品洗凈晾干后備用.

　　先將玻璃紙用蒸餾水浸透，平放在一塊玻璃上，放三根壓條于其上(這樣就形成一個膠室)，再放聚碳酸脂薄膜，最后放一張玻璃板，放壓條的地方用文具夾夾緊，兩塊大約錯開一公分，以備由此處灌膠.

　　3)聚丙烯酰胺凝膠板的制備

　　取30%凝膠母液3.2毫升，依次加50%分析純甘油3.6毫升,雙蒸餾水10毫升，40%載體兩性電解質0.72毫升，10%過硫酸胺0.1毫升，(最好用時配制，或在制備一周內使用)，充分混合后，從框墊開口處注入玻璃板夾層內的玻璃紙和聚碳酸脂薄膜之間的空間內，室溫放置1小時左右，去掉文具夾及聚碳酸脂薄膜及其上的玻璃板，既為聚丙烯酰胺凝膠板.

　　4)打開低溫循環(huán)器開關使水溫降至4℃左右.

　　2.加樣

　　用1*0.5(或0.6*0.5)厘米濾紙片在0.1-0.5%濃度的樣品液中浸潤，貼于凝膠板1.5-2厘米處，與凝剿班的方向平行，每個樣品濾紙片間隔0.5厘米.

　　3.電泳

　　1)放置電級紙條，以3-4層寬0.6-1.0厘米、長10厘米的干濾紙條以1mol/L氫氧化鈉置于凝膠板陰級側的邊緣，同樣的濾紙條浸以1mol/L磷酸置于陽極側的邊緣.

　　2)將鉑金絲電極板放于凝膠板上，使連接電源陽極和陰極的電極絲分別壓在陽極側和陰極側的電極濾紙條上，最后蓋好電泳槽蓋.

　　3)接通電源開關，按下"預置"開關鍵，預置電壓、電流及功率的參考值分別為2500V、50mA、功率80W.然后按下開關鍵，電源即有輸出，電泳開始.一般選擇穩(wěn)壓或穩(wěn)功率，電泳時間1-1.5小時.

　　4.固定

　　電泳結束后，凝膠板以12.5%三氯醋酸固定20分鐘.

　　5.染色

　　取0.4克考馬斯亮藍R250加入120毫升甲醇液中20克三氯醋酸，12克磺基水楊酸，蒸餾水400毫升，制成考馬斯亮藍染色液，將經(jīng)固定的凝膠板放置于染色液中，60℃水浴中染色30分鐘.

　　6.脫色

　　乙醇、冰醋酸及蒸餾水按1:3:6的比列緩和即為脫色液.將染色后的凝膠板放置于該脫色液中，室溫下脫色24-43小時.

　　7.繪PH曲線(此步驟需在電泳結束后，固定之前進行)，測等電點.

　　8.照相

　　凝膠板干燥處理后保存或照相后保留底片.

　　瓊脂糖電泳

　　1.先用膠條封住凝膠托盤兩端，然后放在水平臺上.把試樣格固定在試樣格架上，放在凝膠托盤合適的位置上.把配置好的瓊脂糖凝膠倒如槽中(主義瓊脂糖凝膠的溫度不要超過60℃).待凝膠聚合后，輕輕拔掉試樣格.

　　2.在電泳槽兩端活動槽中加上緩沖液，把凝膠托盤兩端的膠條撕掉并移到電泳槽中.

　　3.用與凝膠等同寬度的四層濾紙約20mm長，并折成直角;濾紙的一端搭在凝膠板上，另一端浸在緩沖液中.

　　4.點樣.

　　5.插上電源線，接同電源開始電泳.

　　6.主義不要接錯正負極，檢查無誤后打開電泳儀電源開關.根據(jù)凝膠板的薄厚選擇適宜的電壓與電流即可電泳.

　　7.電泳實驗結束后，先關閉電泳儀電源開關;隨之打開電泳槽取出凝膠托盤.

　　8.觀察和照相：在254nm或300nm紫外燈下觀察，或用135照相機加橙色濾光片在紫外分析儀上照相.

　　3、 SDS-PAGE膠的干燥

　　膠干燥時遇到的主要問題是凝膠的變形和破裂。將凝膠放在Whatman 3MM濾紙上可防止干燥凝膠變形，但凝膠是否破裂取決于凝膠的厚度和干燥器的質量，因此，應盡量使用薄膠并使凝膠干燥器處于良好狀態(tài)，使其真空壓力波動極少。

　　(1)試劑與配制：

　　固定液：冰醋酸:甲醇:水(10:20:70)

　　(2)電泳后的凝膠用5～10倍體積固定液在室溫下固定，酸性固定液擴散后可使凝膠中的溴酚藍變黃。藍色全部消失后，繼續(xù)固定5min。為防止凝膠破裂，在進行步驟(2)之前可將凝膠浸泡于含20%甲醇、30%甘油的溶液中過夜。

　　(3)將凝膠標記好方向后放在保鮮膜或玻璃紙上面，上面放一張比凝膠四周長出1～2cm的Whatman 3MM濾紙。

　　(4)另將一張濾紙放在凝膠干燥器上。將Whatman 3MM濾紙/凝膠/保鮮膜或玻璃紙，放在凝膠干燥器上的濾紙上面，保鮮膜或玻璃紙在最上面。

　　(5)放下凝膠干燥器的蓋子，抽真空使凝膠四周封閉以干燥凝膠，干燥時間常由廠家提供，一般0.75mm厚凝膠干燥2h，如50～65℃可加快干燥進程。

　　釋放真空。如加熱狀態(tài)下干燥，則先停止加熱并自然冷卻10min后再釋放真空。