1.分光光度法定義與應(yīng)用

　　1.1定義:分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的分析檢測(cè)技術(shù).

　　1.2特點(diǎn):靈敏,精確,快速和簡(jiǎn)便,在復(fù)雜組分系統(tǒng)中,不需要分離,即能檢測(cè)出其中所含的極少量物質(zhì).

　　1.3應(yīng)用:生物<>化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質(zhì),核酸,酶等的快速定量檢測(cè).

　　2.分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理

　　2.1分光光度計(jì)的分類

　　2.2分光光度計(jì)工作原理

　　2.3分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)

　　2.4分光光度法的測(cè)量誤差

　　2.5顯色反應(yīng)及其影響因素

　　2.1分光光度計(jì)的分類

　　分光光度計(jì)的分類

　　紅外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于760nm的紅外光區(qū)

　　可見(jiàn)光分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見(jiàn)光區(qū)

　　紫外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)

　　2.2分光光度計(jì)工作原理

　　人眼可見(jiàn)的光只占電磁波譜的很小—部分(400~760nm)

　　它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率最小的無(wú)線電波到頻率最大的γ-射線排成一列,即組成電磁波的波譜,如下圖所示.

　　2.2.1分光光度計(jì)的光譜范圍

　　包括波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.

　　鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜,光通過(guò)三棱鏡折射后,可得到由紅,橙,黃,綠,藍(lán),靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源.

　　氫燈的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400nm波長(zhǎng)的光譜,可作為紫外光光度計(jì)的光源.

　　2.2.2物質(zhì)的吸收光譜(1)

　　如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.

　　不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).

　　2.2.2物質(zhì)的吸收光譜(2)

　　當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí),透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱.因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收,只有一部分光可透過(guò)溶液.

　　入射光=反射光 分散光 吸收光 透過(guò)光

　　如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:

　　入射光=吸收光十透過(guò)光

　　2.2.3物質(zhì)吸光度(A)與透射比(T)的關(guān)系

　　設(shè)I0為經(jīng)過(guò)空白校正后入射光的強(qiáng)度;I為透過(guò)光的強(qiáng)度.

　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)得知I=I0?10-εcl

　　式中,c表示吸收物質(zhì)的摩爾濃度;l表示吸收物質(zhì)的光徑,用cm表示;ε表示吸收物質(zhì)的摩爾消光系數(shù),它表示物質(zhì)對(duì)光的吸收特性,不同物質(zhì)的ε數(shù)值不同.所以I/I0=10-εcl

　　令T(透射比)=I/I0T=10-εcl

　　若以T對(duì)吸收物質(zhì)的濃度作圖,則得圖1-5-2中的曲線.

　　由上式可得1g(1/T)=εcl

　　lg(l/T)為物質(zhì)的吸光度(A)A=1g(1/T)

　　2.2.4Lambert-Beer定律(E=εcl)

　　上式說(shuō)明了物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.

　　2.3分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)

　　無(wú)論哪一類分光光度計(jì)都包括:光源,單色器,吸收池,檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表.分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示:

　　5個(gè)基本部件

　　分光光度計(jì)的基本部件(1):

　　光源:分光光度計(jì)上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見(jiàn)光區(qū),近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢絲燈作為光源;在紫外光區(qū)多使用氫弧燈.

　　單色器:把混合光波分解為單—波長(zhǎng)光的裝置.在分光光度計(jì)中多用作為色散元件.

　　吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來(lái)盛被測(cè)的溶液.在低于350nm的紫外光區(qū)工作時(shí),必須采用石英池或熔凝石英池.

　　分光光度計(jì)的基本部件(2):

　　吸收池(比色皿)必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質(zhì)料,厚度應(yīng)完全相同,以免產(chǎn)生誤差.比色皿上的指紋,油污或壁上的沉積物都會(huì)顯著地影響其透光性,因此在使用前務(wù)必徹底清洗.

　　常用光電池,光電管和光電倍增管三種.

　　測(cè)量裝置—般常用的紫外光和可見(jiàn)光分光光度計(jì)有3種測(cè)量裝置,即電流表,記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元.現(xiàn)代的儀器常附有自動(dòng)記錄器,可自動(dòng)描出吸收曲線.

　　檢測(cè)器

　　棱鏡與光柵

　　棱鏡:光波通過(guò)棱鏡時(shí),不同波長(zhǎng)的光折射率不同;因而能將不同波長(zhǎng)的光分開(kāi).玻璃對(duì)紫外線的吸收力強(qiáng),故玻璃棱鏡多用于可見(jiàn)光分光光度計(jì).石英棱鏡可在整個(gè)紫外光區(qū)傳播光,故在紫外光分光光度計(jì)中廣為應(yīng)用.

　　衍射光柵:在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線(每英寸約刻15000—30000條).由于刻線處不透光,通過(guò)光的干涉和衍射使較長(zhǎng)的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜.

　　棱鏡單色器裝置示意圖

　　光源照到棱鏡(或光柵)以前,先要經(jīng)過(guò)一個(gè)入射狹縫,再通過(guò)平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過(guò)棱鏡的光再經(jīng)另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內(nèi)可得一清楚的光譜圖.如在焦線處放—出射狹縫,轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡使光譜移動(dòng),就可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個(gè)裝置稱為"單色器"

　　檢測(cè)器---光電池

　　光電池裝在一個(gè)特制的匣子里面由3層物質(zhì)組成的圓形或長(zhǎng)方形薄片.第一層是一種導(dǎo)電性良好的金屬,這是光電池的負(fù)極.中間極薄的一層是半導(dǎo)體硒,第3層是鐵,這是光電池的正極.當(dāng)光電池受光照射以后,半導(dǎo)體硒的表面逸出電子,這些電子只向負(fù)極方向移動(dòng),而不向正極移動(dòng),因此在上下兩金屬片間產(chǎn)生一個(gè)電位差,線路連通時(shí)即產(chǎn)生電流

　　檢測(cè)器---光電管

　　光電管光電管是由封裝在真空透明封套里的一個(gè)半圓柱型陰極和一個(gè)絲陽(yáng)極組成.陰極的凹畫上有一層光電發(fā)射材料,此種物質(zhì)經(jīng)光照射可發(fā)射電子.當(dāng)在兩極間加有電位時(shí),發(fā)射出來(lái)的電子就流向絲陽(yáng)極而產(chǎn)生光電流.對(duì)于相同的輻射強(qiáng)度,它所產(chǎn)生的電流約為光電池所產(chǎn)生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產(chǎn)生的電流容易放大.

　　檢測(cè)器---光電倍增管

　　光電倍增管它比普通的光電管優(yōu)越,它可將第一次發(fā)射出的電子數(shù)目放大到數(shù)百萬(wàn)倍.當(dāng)電子打在兼性陽(yáng)極上時(shí),能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被第二個(gè)兼性陽(yáng)極所吸引,同樣再產(chǎn)生更多的電子.

　　此過(guò)程重復(fù)9次后,每個(gè)光子可形成106~107個(gè)電子.這些電子最后被收集在陽(yáng)極上.所得到的倍增電流可進(jìn)一步加以放大和測(cè)量.