1.如何選用培養(yǎng)基?

　　培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)�？傊�，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI- 1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基(SFM)

　　2.為什么要熱滅活血清?

　　加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。

　　3.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?

　　L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

　　4.GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?

　　GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

　　GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

　　5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?

　　酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

　　6.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞?

　　用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200-2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。

　　7.如何消除組織培養(yǎng)的污染?

　　重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過濾器。

　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。

　　下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟:

　　1 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

　　2 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

　　3 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

　　4 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2-3代。

　　5 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

　　6 重復(fù)步驟4。

　　7 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代，確定污染是否以已被消除。

　　8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?

　　丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

　　9.為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀?

　　GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲(chǔ)存在2-8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在-20℃儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。

　　10.目錄上說，Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?

　　HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在 CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。

　　11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?

　　Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測(cè)：

　　End-Point Determination of Endotoxin Content

　　噬菌體檢驗(yàn)

　　生物化學(xué)檢測(cè)

　　激素的檢測(cè)

　　血紅蛋白檢測(cè)

　　Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)及方法學(xué)檢測(cè)

　　12.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?

　　二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

　　13.制備 lipid-DNA的方法會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎?

　　是的。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中�；旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對(duì)于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基(800μl)。(注意以上是35mm培養(yǎng)皿使用體積)。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。對(duì)于每一種脂質(zhì)體的詳細(xì)的信息可以參考產(chǎn)品說明書。

　　14.我使用SF900 Ⅱ時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好?

　　如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%)，讓血清給蛋白酶提供作用底物。

　　15.如何檢測(cè)內(nèi)毒素(熱源)水平?

　　LAL(Limulus Amebocyte Lysate)試驗(yàn)是可用的最敏感和特異的檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟(Limulus polyphemus)血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動(dòng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)(絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng))，通過修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟(血細(xì)胞)裂解物。

　　胎牛血清的內(nèi)毒素檢測(cè)是在Grand Island，按照手冊(cè)上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對(duì)血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。(通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會(huì)抑制凝膠過程，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。)

　　16.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎?

　　如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。

　　17.20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會(huì)改變嗎?

　　對(duì)于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。

　　下表列出溫度改變10℃時(shí)，PH值的變化情況

　　例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時(shí)PH值為 7.4-(2x0.310)=6.78

　　緩沖系統(tǒng) pKa/20℃ [Delta]pKa/10℃

　　Mes 6.15 -0.110

　　Ada 6.60 -0.110

　　Pipes 6.80 -0.085

　　Aces 6.90 -0.200

　　Bes 7.15 -0.160

　　Mops 7.20 -0.013

　　Tes 7.50 -0.200

　　Hepes 7.55 -0.140

　　Tricine 8.15 -0.210

　　Tris 8.30 -0.310

　　Bicine 8.35 -0.180

　　Glycylglycine 8.40 -0.280

　　18.室溫下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少?

　　緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同的PH值。

　　4℃ 25℃ 37℃

　　8.1 7.5 7.2

　　8.2 7.6 7.3

　　8.3 7.7 7.4

　　8.4 7.8 7.5

　　8.5 7.9 7.6

　　8.6 8.0 7.7

　　8.7 8.1 7.8

　　8.8 8.2 7.9

　　8.9 8.3 8.0

　　9.0 8.4 8.1

　　9.1 8.5 8.2

　　9.2 8.6 8.3

　　9.3 8.7 8.4

　　9.4 8.8 8.5

　　19.昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值和滲透壓是多少?

　　生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值對(duì)細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類昆蟲細(xì)胞系，在PH值 6.0-6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的最適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

　　20.High Five細(xì)胞有任何其它名稱嗎?

　　High Five細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

　　21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別?

　　PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質(zhì)的單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。如果作為雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基使用，PFHM-II可能需要補(bǔ)充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基，也是單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。它包含低水平的蛋白質(zhì)。

　　22.在High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少?

　　High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

　　23.High Five細(xì)胞用多大的密度凍存?

　　3.0x10E6 cells/ml

　　24.在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么?對(duì)我的細(xì)胞有害嗎?

　　可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對(duì)實(shí)驗(yàn)不會(huì)有不利的影響。

　　25.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞?能用胰蛋白酶消化嗎?

　　我們強(qiáng)力推薦使用脫落細(xì)胞的方法，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)破壞性最小，生活力最高。正如手冊(cè)上所顯示，通過使用巴氏德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對(duì)必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。

　　胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞：

　　1. 去除培養(yǎng)基。

　　2. 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細(xì)胞表面)洗滌細(xì)胞，去除PBS.

　　3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細(xì)胞表面)。

　　4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。

　　5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。(培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。)

　　6. 離心(1100rpm)沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。

　　7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。

　　26.在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少?

　　為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。

　　27.如何評(píng)估ES細(xì)胞合格的胎牛血清?

　　使用D3 ES細(xì)胞。這是一個(gè)對(duì)于胎牛血清中生長(zhǎng)促進(jìn)、生長(zhǎng)抑制和分化因子非常敏感的細(xì)胞系。

　　相關(guān)生長(zhǎng)效率分析：

　　當(dāng)ES細(xì)胞以非常低的密度傳入包含10%胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，檢測(cè)開始和支持ES細(xì)胞克隆的能力。

　　細(xì)胞毒分析：

　　當(dāng)以非常低的密度傳入包含30%胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，檢測(cè)ES細(xì)胞和feeder細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。

　　相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：

　　檢測(cè)胎牛血清支持未分化ES細(xì)胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評(píng)估分化程度。未分化的ES細(xì)胞小顏色深紅粉紅，分化的細(xì)胞較大，豐滿，顏色較淺。

　　所有的分析在沒有ESGRO的情況下進(jìn)行的，培養(yǎng)基中出現(xiàn)ESGRO會(huì)掩蓋由胎牛血清所導(dǎo)致的問題。(ESGRO或LIF經(jīng)常用來保持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。)

　　經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大約8批中有1批可以用來培養(yǎng)ES細(xì)胞。

　　28.在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代?隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會(huì)降低嗎?

　　通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時(shí)候記數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95%的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。